随着生命科学研究的不断深入，仅仅对生物样本的物理切片进行结构观察研究，已经无法满足器官功能研究的迫切需要。例如，在神经系统相关研究中，由于大多数神经元向多个方向延伸，形成复杂的神经网络，而单个微米尺度切片的结构信息无法提供整个神经系统的3D结构。脑部神经投射、血管网络结构以及肿瘤微环境等重要科学问题的研究，都需基于三维空间信息进行分析研究。获取三维的结构信息，一种方式是通过连续的组织切片，然后进行图像重建，但是由于传统切片所产生的剪切力很容易造成组织扭曲甚至撕裂，导致三维重建的难度增加。
随着显微3D成像技术的快速发展, 人们开始尝试无切片直接成像。但是不透明组织限制了光的穿透深度，严重制约了光学成像能实现的深度(通常为微米尺度)。因此，组织透明化技术应运而生。组织透明化，顾名思义即让组织变得透明，其通过使用化学试剂去除造成光散射和光吸收的组分，从而让组织内部光学特性均质和折射率（refractive index, RI）均一，使得深度3D组织成像成为可能，为生物组织高分辨率结构信息的获取提供了一种创新的革命性技术方法。
生物组织是各种不同细胞的有机集合。由于组织的组成成分（细胞、细胞器和各种纤维结构）具有不同的折射率，可见光进入组织后，会发生反射、吸收、散射等物理过程。生物组织中基本组成成分和结构的大小、形状、密度和折射率，以及入射光的偏振状态，决定了光在组织中的传播特性。其中，多次吸收和散射过程是导致光束最终衰减和不透明的主要原因[3]。当一个非吸收性物质具有均一的折射率时，该物质趋于透明，各种透明化技术的研究也是基于这两方面对透明化的效率与效果不断提高。
组织中不同的成分具有不同的吸收光谱[3]。例如，ATP、DNA和脂肪酸等在200-300 nm附近具有特征性的吸收峰。而血红素和黑色素这类物质光谱范围很广。因此，脱色是实现透明化组织深度成像的重要策略。充分清除血红素对于清除整个器官，特别是富含血红素的组织的透明化非常关键。简单的缓冲液灌注可以有效去除血管中的红细胞。但在特定的组织和器官，如脾脏，灌注后仍有大量的残余血。用强酸(如盐酸丙酮)或强碱(如氢氧化钠)处理样品可以使血红素解离，从而实现有效的色素去除。黑色素是脊椎动物视网膜色素上皮中一种突出的色素，在脂类和水性溶剂中都很难溶解。目前，黑色素的去除只能通过强的氧化处理，如用H2O2[1]。
组织包含不同组成成分和内部结构，如细胞、细胞器、内含物以及不同的纤维和管状/片层结构的种类及数量不同，使得其具有高度的不均一性。组织中包含RI较高的成分(RI~1.39-1.52)，如纤维、细胞膜、细胞核、细胞器，以及RI较低的周围介质(RI~1.33-1.37)，如组织间液和细胞质[4-5]。这些复杂的成分和结构折射率的差异导致了强烈的光散射，阻止光穿透组织，使深度成像受阻。基于该原理，通过减少组织内部RI的差异并进行RI匹配使得组织内部折射率均一化可以有效解决光散射问题。
Graaff等[6]提出简化的Mie散射理论，将优化散射系数（μs'）表述为：
其中，a为粒子的平均直径，ρs为粒子的体积密度，λ为波长，ns和nb分别为散射粒子和背景的RI。RI匹配因子（m）由ns/nb定义。根据这个公式，散射特性在很大程度上取决于RI匹配因子m，当m趋于1时，μs'趋于0，散射也就越小，但散射粒子的大小和密度的变化也会导致散射特性的变化。
基于这一基本物理原理，多种实现RI匹配的方法已被报道，如去除组织中低RI的水或高RI的脂质，通过蛋白质变性后加入与蛋白质RI相近的匹配溶液等。其中，RI匹配溶液主要包括亲水（甘油、蔗糖等）和疏水性（水杨酸甲酯、DBE等）试剂。
综上，组织透明化的主要物理原理是通过去除组织中的吸光物质减少光吸收，通过组织均一化和折射率匹配减少光散射。基于以上基本原理，至今已经报道了多种（>10种）的组织透明化方法。各种透明化技术的快速发展为各种组织的三维成像提供了新的工具，使得对多种生物组织（器官）的3D结构的获取和理解成为可能，展现出重要的科学价值和临床诊断价值。
参考文献：
[1]Yu T, Zhu J, Li D, Zhu D. Physical andchemical mechanisms of tissue optical clearing. iScience. 2021 Feb12;24(3):102178. 10.1016/j.isci.2021.102178.
[2] Tuchin, Valery. (2015). Tissue Optics and Photonics: BiologicalTissue Structures. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 1. 3-21.10.18287/JBPE-2015-1-1-3.
[3] Tuchin, Valery. (2015). Tissue Optics and Photonics: Light-TissueInteraction. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 1. 98-134. 10.18287/JBPE-2015-1-2-98.
[4] Tuchin, Valery. (2005). Optical clearing of tissue and blood usingimmersion method. Journal of Physics D: Applied Physics. 38. 2497.10.1088/0022-3727/38/15/001.
[5] Johnsen, Sönke & Widder, Edith. (1999). The Physical Basis ofTransparency in Biological Tissue: Ultrastructure and the Minimization of LightScattering. Journal of theoretical biology. 199. 181-98.10.1006/jtbi.1999.0948.
[6] Graaff, Reindert & Aarnoudse, Jan & Zijp, J & Sloot,Peter & Mul, F. & Greve, Jan & Koelink, Marco. (1992). ReducedLight-Scattering Properties for Mixtures of Spherical Particles: A SimpleApproximation Derived from Mie Calculations. Applied optics. 31. 1370-6.10.1364/AO.31.001370.
