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完整组织透明化技术丨前世、今生、未来
来源: | 作者:诒福科技 | 发布时间: 2022-10-17 | 340 次浏览 | 分享到:
组织在细胞分辨率尺度的3D空间结构是理解器官正常功能和病理的的关键基础信息[2]。因此，获取完整生物组织/器官在单细胞分辨率的3D空间结构，一直是生命科学领域的重要目标之一。传统的组织研究通常都基于组织切片，难以提供完整器官的高分辨率3D结构信息。组织透明化技术通过大幅减少组织对光的吸收和散射，实现组织/器官的透明化，使得直接应用高分辨率光学显微镜对全组织/器官3D成像成为可能。近十年来，新的组织透明化技术层出不穷，日趋成熟，且在多个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了组织透明化技术发展过程中具有代表性的技术突破和目前组织透明化的主要类型。


前世（起源）                 


1914年，德国解剖学家WenerSpalteholz首次发明了一种组织透明化方法，称为Spatleholz[3]。Spatleholz在研究心脏冠状动脉之间的吻合机制过程中，发现用传统解剖方法无法取得任何突破性进展，意识到要有新发现，就必须使用新方法。他通过对肌肉组织的研究发现：组织在经酒精、丁香油或二甲苯等脱水处理后变得透明，且当光在组织表面不反射时即组织的光的折射率（RI）和介质或固定组织的溶液的折射率（RI）相同时组织的透明度最高。

Satleholz通过对不同组织的RI进行研究，发现不同组织具有不同的RI，且RI会随着动物年龄的变化而变化。基于以上研究，Spatleholz发明了一种透明液，即水杨酸甲酯(methylsalicylate)和苯甲酸苄酯（benzylbenzoate,BB）结合冬青油(wintergreenoil)[5]。开启了完整组织透明化研究的大门。但该方法的缺点是在透明化过程中对组织结构破坏很大，损伤组织表面达数厘米[5]。因此，该方法只能应用于体积较大且不需要观察组织外表层的样品组织学研究。


  




今生(进展)                  


2007年德国马克斯·普朗克精神病学研究所的Hans-UlrichDodt等人提出了一种新的透明化方法，称为BABB[1]。该方法也是使用有机溶剂进行脱水后进行光折射匹配。但将Spatleholz方法中的水杨酸甲酯换成了苯甲醇（BA），由苯甲醛（BA）和苯甲酸苄酯（BB）组成的混合液（BABB）进行透明化，样品荧光蛋白具有一定保护性。且该技术将透明化技术与光片显微镜（Ultramicroscopy）技术结合首次呈现组织三维结构[1]，做到了在细胞分辨率层次对固定的小鼠胚胎头部进行光学断层扫描进而在完整的头部中可视化整个神经网络，揭开了完整组织三维微观结构的面纱。


 



2013年美国斯坦福大学的KwanghunChung等人研发出一种将完整组织转化为水凝胶-组织混合形式（与亲水性聚合物的三维网络交联）的透明化方法，称为CLARITY[2]。相较于有机溶剂透明化方法，该方法利用丙烯酰胺或双丙烯酰胺对细胞内部结构进行很好地固定，使得在后期脱脂等处理后组织内部结构依然能够保真重现；其次，该方法为非有机溶剂方法，所用溶剂均是亲水性的，使得组织中的荧光蛋白得到有效保护。该方法使组织内部结构稳定的同时仍具有光学透明性和大分子可渗透性。针对CLARITY方法难以实现富含脂肪组织(如肝脏等)完全透明化的难题，诒福科技创始团队发明了PL-CLARITY方法[14]。



CLARITY技术被著名科普杂志《科学美国》评为2013年改变世界的十大创新之一以及2014年年度方法之一。自此，完整组织透明化技术的研究迎来了它的黄金时代。
经科学家的不断研究和突破，多种组织透明化方法相继被提出和优化。依据各透明化方法中使用的溶剂及其作用原理[11]我们对目前现有的透明化方法进行分类和比较，主要分为三类[3]：
1.有机溶剂型：BABB、3DISCO、iDISCO、uDISCO、vDISCO、PEGASOS、a-uDISCO [4]、SHANEL；
2.水溶剂型：CUBIC[7]、Scale/A2、Scale/U2、Ce3D、ClearT、SeeDB、FRUIT、FocusClear、TDE；
3.水凝胶型：CLARITY、PACT、SWITH、Bone-CLARITY、PL-CLARITY、PARS、SHIELD；
主要从适用范围、组织体积改变程度、对荧光蛋白的保护及有无毒性等几个方面对该三类透明化方法进行比较[12]：


分类
优点
缺点
有机溶剂型
可用于多种类型组织，透明度高；操作简单；耗时短
组织收缩严重[8]；对荧光蛋白破坏性大；有毒性；不能二次染色；对含血红素较多的组织透明化效果欠佳
水溶剂型
组织体积几乎不变或变化较小；可用于多种类型组织；透明度高；可二次染色；无毒[13]
组织膨胀，膨胀程度与透明化效果呈正相关；对荧光蛋白有一定破坏（除简单浸泡型如FocusClear、TDE外）；耗时长
水凝胶型
组织体积几乎不变，或轻微膨胀；对荧光蛋白保护较好；可二次染色；无毒[9]
操作复杂，在剥离凝胶时易产生机械损伤；耗时长；对含脂肪较多的样品透明化效果欠佳

不同透明化方法均有优缺点，实验时应根据实验需求选择具体的透明化方法。


未来(应用)                       


毫无疑问，组织透明化技术革命性地改变了我们研究生物组织的手段，使得我们有能力直接获取完整器官3D高分辨率空间结构信息。目前透明化技术在神经生物学领域的应用得到广泛认可[10]，在胚胎生物学、再生生物学、组织3D打印和肿瘤生物学等诸多领域的应用也呈现显著增长趋势。事实上，完整组织透明化技术在临床病理诊断和伴随诊断等方面也有着巨大前景和潜力。相信随着透明化技术研究的不断推进以及3D显微成像技术的迅速发展，该技术将造福于更多学科领域的发展。


 


参考文献

1. DodtH-U, Leischner U, & Schierloh A. Ultramicroscopy : Three-dimensionalvisualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods .2007.04,VOL4,NO.4:331–336

2. Chung K, Wallace J＆Kim S-Y. Structural and molecular interrogation of intact biologicalsystems.Nature.2013.05,497(7449):332-337

3. Richardson D, & LichtmanJ. Clarifying Tissue Clearing.Cell.2015.07,162(2):246-257

4. Yusha L, Jiangyi X&Peng W. Optimization of GFP Fluorescence Preservation by a Modified uDISCOClearing Protocol. Frontiers in Neuroanatimy.2018.08,VOL12:67

5. Azaripour A, LagerweijT, Scharfbillig C, et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging oftissues with special reference to connective tissue.Progress in Histochemistry and Cytochemistry.2016.11.51:9-23

6. TAINAKA K, KUNO A, KUBOTA SI,et al. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-BodyCell Profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 2016.03,32(6):713-741

7. Matsunoto K, MitaniT-T, Horiguchi S-A, et al. Advanced CUBIC tissue clearing forwhole-organ cellprofiling. NATURE PROTOCOLS.2019.12,VOL.14:3506-3537

8. Pan C,Cai R, QuacquarelliF-P, et al . Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms usinguDISCO. NATURE METHODS.2016.10,VOL.13,NO.10.1038/nmeth.39 64

9. Tomer R, Ye L, HsuehB, et al. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intacttissues. NATURE PROTOCOLS.2014,VOL.9,NO.7:1682-1697

10.  Ueda H-R, Erturk A, ChungK, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. NATURE REVIEWS.2020.02,VOL21：61-79

11.  Matryba P, SosnowskaA, Wolny A, et al. Systematic Evaluation of Chemically Distinct Tissue OpticalClearing Techniques in Murine Lymph Nodes. The Journal of Immunology.2020.01,doi:10.4049/jimmunol.1900847

12.  田婷，杨朝阳，李晓光.组织透明化技术的研究与应用[J].中国组织工程研究，2020，24(21):3363-3371

13. 王培新,张丹，尚爱加，等.组织透明技术[J].神经解剖学杂志，2016，32(1):124-128

14. Lai M，LiX-W，Li J, et al. Improved clearing of lipiddroplet-rich tissues for three-dimensional structural elucidation. Acta BiochimBiophys Sin.2017.08:1-3